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- 단백질 자체의 분광학적 특성인 자외선 흡광 현상을 이용하는 단백질 정량 법이다.
- 단백질을 구성하는 아미노산 중 방향족 고리를 지닌 아미노산인 Tyr의 phenol group과 Trp의 indole ring의 자외선 흡광이 정량적인 성질을 갖기 때문에 가능하다.
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단백질 실험의 기본!
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단백질 정량
UV 흡광도 분석. 단백질 농도를 측정하기 위해 자외선(UV) 흡광을 사용하는 것은 상대적으로 간단한 단백질 정량 분석입니다. 방향족 측쇄를 가진 …
Source: www.sigmaaldrich.com
Date Published: 12/3/2022
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[단백질] 단백질 정량법
단백질의 정량법 절대적인 단백질의 농도를 측정하는 방법 종류. UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법, 기타 간편한 dye-binding법 등
Source: bioprocess-life.tistory.com
Date Published: 11/19/2022
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단백질 측정, 정량분석과 분석 | Molecular Devices
단백질 정량분석은 샘플의 총 단백질 농도를 측정하는 것입니다. 단백질 정량분석은 280nm의 Absorbance를 통해 직접 또는 더 높은 민감도 등의 장점이 있는 비색(BCA, …
Source: ko.moleculardevices.com
Date Published: 1/2/2022
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단백질 시료의 농도 측정 – Intins – 인틴스
OCEAN HDX 분광계로 측정한 UV 흡광도를 사용하여 단백질 농도 정량 측정 단백질은 임상, 진단 및 연구 실험실에서 흔히 볼 수있는 샘플입니다.
Source: intins.co.kr
Date Published: 9/25/2022
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UV를 이용한 단백질 정량에 대한 실험 보고서 레포트 – 해피캠퍼스
EXP2. Protein Determination 실험목적 단백질 정량의 기본원리를 이해하고 Lowry법, BCA법, Bradford법 등의 차이점을 알바보자고 한다. 실험원리 단백질 농도를 정량 …
Source: www.happycampus.com
Date Published: 12/6/2021
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Cary 3500 Multicell UV-Vis를 이용한 단백질 분석의 장점 – Agilent
때문에 UV-Vis. 분광기를 이용해 정량 분석을 할 수 있습니다. 흡광도 계수를 안다면 램버트비어 법칙(1)에. 따라 해당 아미노산을 포함한 단백질의 농도를 측정할 수 …
Source: www.agilent.com
Date Published: 10/19/2022
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단백질 정량 (Protein Quantification) : 주요브랜드 자세한 …
단백질 관련 실험에서는 sample간 특정 단백질 양의 차이를 확인하기 때문에 각 sample의 단백질 총량을 맞추는 과정이 필요합니다.단백질 정량은 …
Source: dawinbio.com
Date Published: 11/3/2022
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주제에 대한 기사 평가 단백질 정량 uv법
- Author: 써바싸TV
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- Date Published: 2022. 1. 21.
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단백질의 농도측정 실험 – UV assay
분리한 단백질을 실험에 이용하기 위해서는 단백질의 정확한 농도를 알아야 하는 경우가 많다.
단백질을 정량하는 방법에는 대표적으로
UV assay
Bradford assay
Biuret assay
Lowry assay
BCA assay 가 있다.
이번 포스팅에서는 UV assay에 대해 알아본다. ^^
1. UV assay
단백질 자체의 분광학적 특성인 자외선 흡광 현상을 이용하는 단백질 정량 법이다.
단백질을 구성하는 아미노산 중 방향족 고리를 지닌 아미노산인 Tyr의 phenol group과 Trp의 indole ring의 자외선 흡광이 정량적인 성질을 갖기 때문에 가능하다.
즉 Tyr잔기나 Trp잔기의 숫자가 많을수록 자외선 흡광이 많아지며 용액 중에 존재하는 단백질 농도에 비례하게 된다.
단백질의 자외선 흡광은 280nm 파장에서 최대치를 갖는데, 주어진 단백질을 구성하는 Tyr과 Trp잔기의 개수를 알면 이론적인 자외선 흡광계수 (UV absorption coefficient, molar extinction coefficient) 를 구할 수 있다.
자외선 흡광계수를 알면 시료의 농도를 측정할 수 있다. 이에는 Lambert-Beer의 법칙 이 적용된다.
◆ Lambert-Beer의 법칙
A= log I0 / log I = ebc
A: 흡광도 Absorbance
b:빛이 지나가는 시료층의 두께 path length (cm)
c: 단백질 시료의 농도 concentration (M) <- 구하고자 하는 것 e: 자외선 흡광 계수 molar extinction coefficient (M^-1* cm^-1) ◆ 단백질의 Coefficient 값 구하는 법 Bacterial hemoglobin 10 20 30 40 50 60 MLDQQTVDTS KATVPVLKEH GVTITTTFYQ NLFAKHPEVR PLFDMGRQAS LEQPKALAMT 70 80 90 100 110 120 VGAAAQNIEN LPAILPAVQK IAVKHCQAGV AARHYPIVGQ ELLGAIKELL GDAATDDILD 130 140 AWGKAYGVIA DVFIQVEADL YAQDAE ε280 = (5500 × nTrp ) + (1490 × nTyr ) + (125 × n(S-S) ) 의 식으로 구하므로 따라서 ε280 = (5500 × 1Trp ) + (1490 × 3Tyr ) + (125 × 0S-S ) = 9,970 ◆ UV assay의 장 단점 장점 : 단백질의 농도를 빠르게 측정할 수 있다. 측정하는 단백질의 변성이 없다. 더 정확한 농도 측정 방법을 사용하기 전에 간단하게 protein의 존재 여부를 확인하기 위해 이용할 수 있다. 단점: pH, ionic strength, 버퍼(buffer), 염,핵산의 영향을 많이 받는다. 단백질의 조성에 따라 차이가 날 수 있다. 비교적 많은 양의 단백질 시료를 필요로 한다. 시료 안에 같은 자외선 파장대의 흡광을 갖는 물질이 공존할 때는 이용할 수 없다.
단백질 정량
시약-기반 분석
시약-기반 분석은 UV 흡광법에서 관찰된 호환성 문제를 극복할 수 있습니다. 단백질 정량화를 위한 시약-기반 분석의 예에는 바이신코니닉산(BCA), Lowry 및 Bradford 분석법과 같은 발색법을 활용하는 분석이 있습니다. BCA 분석법 및 Lowry 분석법 모두 구리-단백질 복합체의 형성을 포함합니다. 이들은 민갑한 분석법이며 Bradford 분석법 보다 변이성이 적습니다. 그러나, Bradford 분석법은 BCA 및 Lowry 분석법과 다르게 빠르고 수행하기 용이하며 특정 환원제와 호환됩니다.
면역분석법
일부 분석법은 샘플에 여러 단백질이 존재하거나 정량이 검출 한도 미만인 경우 정확한 단백질 정량화를 지원하지 않을 수 있습니다. 다양한 검출법을 이용하는 강력한 면역분석 기술은 여러 샘플 유형으로부터 정확하게 단백질을 정량화하는 대안적인 방법을 제공합니다. 예를 들면, 다중 분석법은 과학자들이 샘플에서 여러 단백질을 동시에 정량화할 수 있도록 합니다. 또한, 단일 분자 계수 기술은 단백질을 페토그램 수준까지 측정할 수 있어 소량의 샘플에서 저수준 단백질의 동정 및 정량화를 돕습니다. 이러한 기술은 이용하는 연구 애플리케이션은 특정 질환 상태를 잘 이해하도록 건강한 조직이나 질병 진행과 연관된 조직에서의 생체표지자 측정을 포함합니다.
[단백질] 단백질 정량법
*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.
단백질의 농도를 측정하는 방법은 다양하게 있으며, 생물학적제제 기준 및 시험법에는 마이크로킬달법, Lowry법, Biuret법을 설명하고 있다.
하지만… 단백질 정량법은 상황과 조건에 따라 다양한 방법을 이용 할 수 있다. DC protein assay kit도 있지만. 나중에 소개 하기로하고 이번에는 기초적인 개념만 잡는 것으로.
단백질의 정량법 절대적인 단백질의 농도를 측정하는 방법
종류
UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법, 기타 간편한 dye-binding법 등
정량법 선택시 주의사항
단백질 종류에 의한 감도의 차이, 방해물질의 유무와 허용농도, 반응액의 pH 등에 따라 적절한 방법을 선택 필요
정량방법
표준물질, 완충용액(blank), 목적 단백질 용액을 차례로 측정하여 검량선으로부터 단백질 농도를 산출
UV법
단백질용액의 흡광도를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정
타이로신과 트립토판에서 발생하는 잔기의 방향족에 기초하여 280 nm부근의 홉광도
측정범위는 0.1〜1 mg/mL
간편하게 측정이 가능하고 시료 또한 회수가 가능한 장점
보유된 타이로 신과 트립토판의 비율과 입체구조 내에서의 노출정도 차이로 정밀한 단백질 정량으로 보기힘듬
단백질의 정제과정이나 일련의 실험과정에서 간접적인 농도 파악용
BSA의 경우 A280(1 mg/mL) = 0.7
A=abc, c=A/ab의 Beer-Lambert 공식
(A는 흡광도, a는 흡광 상수, b는 광로장 1 cm, c는 농도)
Lowry법
Biuret을 더 발전시킨 방법
단백질용액을 알칼리성 조건하에서 먼저 Cu2+와 반응시킨 다음 folin 시약을 첨가
Cu+에 의해 phosphate molybdenum acid(인몰리브덴산)-tungsten acid complex가 환원되어 파랗게 발색
측정 범위 0.2〜2 mg/mL
방해물질 (계면활성제 EDTA 등의 chelate제나 DTT와 2-mercaptoethanol 등의 환원제)
BCA법
Lowry법을 계량한 것
folin 시약의 반응 대신 bicinchoninate(BCA)가 Cu+와 복합체를 형성해 자주색으로 발색하는 반응
Lowry법과 비교하면 방해물질 중 계면활성제의 영향을 받지않음
측정 범위 0.1〜1 mg/mL
신뢰성, 직선성 등이 모두 좋은 방법
단백질의 종류에 따른 발색의 차이적음
반응액이 알칼리성이기 때문에 지질을 함유하고 있는 시료 또한 알칼리성에서 가용화되어 그대로 측정이 가능
Bradford법
coomassie brilliant blue G-250이라고 하는 색소가 단백질의 염기성과 방향족 아미노산 잔기와 결합
흡광도가 465 nm부터 595 nm로 이동하는 것을 이용하는 방법
간단, 신속, 고감도
측정 범위 0.02~01 mg/mL
환원제와 EDTA의 영향을 거의 받지 않음. 계면활성제의 영향받음
반응액이 산성이므로 지질을 대량으로 함유하는 시료에서는 침전을 생성
단백질 측정, 정량분석과 분석
단백질의 측정, 정량분석, 분석은 광범위한 생물학적 과정에 대한 조사의 핵심입니다. 단백질 농도의 측정은 단백질 정제와 표지부터 전기영동을 위한 샘플 준비에 이르는 과정에 필수적입니다.
단백질 정량분석은 샘플의 총 단백질 농도를 측정하는 것입니다. 단백질 정량분석은 280nm의 Absorbance를 통해 직접 또는 더 높은 민감도 등의 장점이 있는 비색(BCA, Bradford 등) 또는 형광 분석 방법을 사용하여 간접적으로 수행합니다. 혈청 또는 세포 용해물과 같은 복잡한 샘플 내의 특정 단백질을 확인하고 측정하기 위해 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 사용할 수 있습니다.
세포 신호전달과 다른 생물학적 과정은 형광 단백질을 사용하여 분석할 수 있습니다. 예를 들어, Green 형광 단백질(GFP)은 Live Cell에서 발현될 수 있으며 실험 조건에 따른 국소화와 단백질 동역학을 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 형광 Emission 특성이 미세환경에 의해 영향을 받는 아미노산인 트립토판은 단백질의 입체형태적 상태 변화에 대한 정보를 획득하기 위해 사용되기도 합니다.
단백질 시료의 농도 측정
※ OCEAN HDX 분광계로 측정한 UV 흡광도를 사용하여 단백질 농도 정량 측정
단백질은 임상, 진단 및 연구 실험실에서 흔히 볼 수있는 샘플입니다. 단백질 추출, 정제 또는 라벨링, 또는 세포에서 추출되거나 생체 분자 간의 상호 작용 연구용으로 표지 된 단백질을 사용한 연구가 일반적입니다. 단백질 농도의 결정은 단백질 연구의 중요한 부분입니다. 이 응용 노트에서 우리는 소 혈청 알부민 (BSA)에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해 Ocean HDX 분광계를 사용합니다. UV, 고배율의 미광 및 고감도 광학에서 높은 감도로 인해 Ocean HDX는 UV 흡광도 측정에 이상적입니다.
※Introduction
단백질은 삶의 중심입니다. 이러한 복잡한 생체 분자는 세포 과정, 신진 대사, 생화학 반응을 촉진하고 구조적 요소로 작용하는 등 중요한 역할을합니다. 모든 생명체의 필수 요소 인 단백질은 종종 생물 의학 진단 연구 및 생명 과학 연구의 주제입니다. 단백질을 포함하는 대부분의 연구는 모색되고있는 해답이나 단백질의 원천에 관계없이 샘플에 존재하는 단백질의 양을 정량하는 것으로 시작합니다.
※ Quantifying Protein Concentration
단백질 농도를 정량화하는 방법은 UV 흡광도를 이용한 직접 검출 또는 착색 된 생성물을 만들기 위해 단백질과 반응하는 시약을 필요로하는 비색계 가시광 흡광도 측정의 두 가지 그룹으로 분류됩니다. 방향족 아미노산 Tryptophan, Tyrosine 및 Phenylalanine이 흡수하는 280nm에서의 직접 흡광도 측정은 상대적으로 빠르며 단백질은 측정에 소모되지 않습니다. 시약을 사용하는 비색 분석은 총 단백질 농도를 제공 할 수 있지만 단백질 불순물은 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
단백질 정량법에 사용 된 정확한 방법에 관계없이, 첫 번째 단계는 관심있는 단백질 또는 표준 단백질의 여러 희석액에 대한 흡광도를 측정하는 것입니다. 직접 UV 흡광도 법의 경우 280 nm에서의 흡광도를 각 시료의 알려진 농도와 비교하여 플롯합니다. Beer의 법칙 (Beer-Lambert 법칙이라고도 함)에 따르면 용액의 흡광도는 흡수 분자의 농도와 빛이 시료를 통과하는 경로 길이에 직접적으로 의존합니다. 이 관계를 통해 우리는 알려진 단백질 시료에 대해 생성 된 표준 곡선을 사용하여 알려지지 않은 단백질 시료의 농도를 결정할 수 있습니다.
Beers Law states …
… where
A (λ)는 파장의 함수로서 용액의 흡수량
ε (λ)는 파장의 함수로서 흡수 분자의 몰 흡광 계수 또는 흡광 계수이다 (L / mol · cm 단위)
c는 용액의 농도 (몰 / L)이고,
l는 용액을 통과하는 빛의 진행 경로 길이 (cm)
미지의 단백질 농도는 데이터 포인트를 통해 그려지는 최적의 선으로부터 결정됩니다. 표준 곡선의 선형 부분은 미지 시료의 농도를 결정하는 데 사용되는 유일한 영역입니다. 표준 곡선의 선형 범위 밖에있는 측정 값을 갖는 시료는 흡광도가 선형 범위 내에들 때까지 희석되어야합니다. 측정 된 농도 범위를 벗어나는 데이터 또는 플롯의 선형 영역을 초과하는 데이터를 기반으로 한 농도 예측은 유효하지 않습니다.
UV 흡광도 측정을 위해 구성된 Ocean HDX 분광계를 사용하여 소 혈청 알부민 (BSA)에 대한 표준 곡선을 생성했습니다. Ocean HDX의 고화질 광학은 UV 흡광도 측정에 이상적이며, 최대 흡광도 레벨을 높이기 위해 초저 광을 사용하고 컴팩트 한 공간에서 탁월한 성능을 제공하는 업그레이드 된 광학을 제공합니다.
※Experimental Procedure
물에서 6 mg / mL BSA (Sigma P / N A2153) 저장 용액을 제조하고 0.02 mg / mL로 희석하여 미지의 단백질 시료의 농도를 예측하기위한 표준 곡선을 만들었다. BSA는 종종 단백질 농도를 예측하기위한 검량선 생성을위한 표준 단백질로 사용됩니다.
흡광도는 OCEAN-HDX-UV-VIS 분광기, DH-2000-BAL 평형 중수소 – 텅스텐 할로겐 광원, CUV-UV 큐벳 홀더, 2 개의 QP230-2-XSR 극한 내염 화성 섬유 및 OceanView 소프트웨어의 흡광도 마법사로 측정했습니다 . BSA는 가시 영역의 빛을 흡수하지 않기 때문에 중수소 램프 만 측정에 사용되었습니다. 흡광도가 발생하는 영역으로 광원을 제한하는 것은 측정에서의 미광을 감소시켜 더 높은 농도의 샘플에 대해 최대 흡광도 수준을 허용합니다. 분광계와 광원을 60 분 동안 예열하여 분광계와 빛이 일정한 온도까지 따뜻해지는 동안 발생하는 드리프트를 제거하여 측정의 안정성을 향상 시켰습니다.
측정 사이에 큐벳 홀더에서 제거되지 않은 단일 석영 큐벳에서 측정이 이루어졌습니다. 희석은 0.5 mL 샘플을 제거하고 0.5 mL 물로 대체하여 큐벳에서 직접 수행했습니다. 일회용 피펫을 사용하여 물을 큐벳에 첨가 한 후 샘플을 혼합 하였다. 희석은 0.02 mg / mL까지 행해졌다.
※ Results
Ocean HDX로 측정 한 단백질 흡광도는 아래 그림 1과 같습니다. Ocean HDX의 매우 낮은 미광 성능으로 280 nm의 방향족 아미노산 피크의 흡광도를 거의 3 AU까지 측정 할 수있었습니다. 3 AU 이상의 흡광도 값은 펩타이드 백본이 약 220 nm를 흡수하는 영역에 대해 측정되었다 (데이터는 나타내지 않음).
그림 1 : 물에 희석 한 BSA의 흡광도. 맥주의 법칙에 의해 예측 된 바와 같이 흡광도는 기기의 선형 범위 내에서 농도가 2.5 AU까지 선형 적으로 증가합니다.
BSA 흡광도 데이터로부터 생성 된 표준 곡선을도 2에 나타내었다. 데이터에서 평준화 오프 또는 롤 – 오프가 2.4 내지 2.5 AU 사이에서 관찰되었다. 이 롤오프는 측정에 존재하는 미광을 나타냅니다. 미광 (다양한 흡광도 측정에 존재)은 시스템으로 측정 할 수있는 최대 흡광도 값을 제한합니다.
미광은 의도하지 않게 감지기의 어느 부분에 떨어지는 설계된 광 경로 바깥 쪽에서 나오는 빛입니다. 검출기는 검출기의 주어진 픽셀에 착륙하는 파장을 구별하지 않으며 단순히 검출기에 닿는 빛의 강도를 측정합니다. 이러한 이유로 빛이 검출되지 않는 픽셀 (파장)에서 검출기에 도달하면 검출기는 그 파장에서 판독 값을 잘못 출력합니다. 이 미광은 일반적으로 의도 된 출처에서 나온 것이지만 분광계 내에서 산란하여 탐지기의 잘못된 부분에 떨어지게되지만, 다른 출처에서 온 것일 수도 있습니다. 이 빛은 시스템에서 얻을 수있는 최대 흡광도에 대한 작동 제한을 설정하고 시스템이 얼마나 어두울 수 있는지를 제한하여 신호 대 노이즈 비율을 줄입니다. 미광의 흔한 원인은 격자에서 고차 반사, 격자 결함, 분광계 내부 반사 및 분광계 하우징의 빛 누출입니다. Ocean HDX는 분광계의 미광이 가장 낮고 흡광도가 가장 높습니다.
그림 2 : 0-6 mg / mL 농도의 30 개 이상의 데이터 포인트를 포함한 BSA 표준 곡선. 미광이 최대 흡광도를 제한하는 2.4와 2.5 AU 사이의 스펙트럼 롤오프 또는 레벨링에 유의하십시오.
그림 3에서 가장 높은 단백질 농도의 데이터 포인트가 플롯에서 제거되어 측정을위한 선형 범위를 평가합니다. R2 값의 향상으로 입증 된 선의 적합도 향상은이 선의 등식이 더 적합하고 단백질 농도의 더 정확한 값을 제공함을 나타냅니다. 일부 롤오프는 2.5 AU에서 여전히 관찰됩니다. 이 지역의 선형성을 평가하려면 4에서 4.5 AU 사이의 농도에서 추가 측정이 필요합니다.
그림 3 : 흡광도 측정을위한 대략적인 선형 범위를 보여주는 BSA 표준 곡선.
이 그래프를 사용하여 미지의 샘플에 대해 측정 된 흡광도 값을 y로하여 best-fit line의 방정식을 사용하여 미지의 BSA 또는 기타 단백질 샘플의 농도를 계산합니다.
※ Conclusions
UV를 이용한 단백질 정량에 대한 실험 보고서 레포트
소개글 생화학 실험- 단백질 정량법에 대한 실험 보고서 입니다(2007년에 작성)
목차 실험목적
실험원리
① UV 법
②Bluret법
③Lowry 법
④BCA법
⑤Bradford법
⑥분광광도계(UV-spectrophotometer)
⑦BSA(Bovine Serum Albumin)
실험기구 및 재료
실험 방법
결과 예측
참고 문헌
본문내용 EXP2. Protein Determination
실험목적
단백질 정량의 기본원리를 이해하고 Lowry법, BCA법, Bradford법 등의 차이점을 알바보자고 한다.
실험원리
단백질 농도를 정량하는 방법에는 UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법 등이 등이 있다. 각각의 감도, 간편함, 단백질의 종류에 의한 감도의 차이, 방해물질의 종류와 허용 농도 및 반응액의 pH 등에 차이가 있으므로 측정할 대상에 따라 적당한 방법을 선택해야 한다.
① UV 법
단순히 단백질 용액의 흡관도를 분광 광도계로 측정하는 방법이다. 단백질에는 주로 tyrosin 및 tryptophan의 측소ㅔ로부터 유래된 280nm 부근의 흡수가 있으나 buffer에는 이부분의 흡수를 가지는 것이 적기 때문에 이것을 측정한다.
측정범위는 0.1~1㎎/㎖ 정도로서 간단하게 sample의 회수가 가능하지만 흡수는 tyrosine, tryptophan의 비율과 구조에 의존하기 때문에 흡광계수는 단백질에 따라 다르다. 따라서 흡광계수가 미리 알려져 있는 단백질의 농도를 결정할 경우, 또 chromatogrphy를 행한 뒤, 어느 부근에 어느 정도의 단백질이 용출되었는가를 대략적으로 조사할 경우에 적합하다. Column의 끝에 flow cell 식의 흡광도계(UV 모니터)를 붙이고 연속적으로 단백질의 요출 패턴을 monitor 하는 것이 가능하다.
②Bluret법
가장 고전적인 비색 정량법으로서 Alkali 성 조건하에서 Cu2+를 단백질용액과 반응시키면 Cu2+으로 되어 peptide 결합과 적자색의 complex를 형성하기 때문에 이것을 분광광계도로 측정한다.
키워드에 대한 정보 단백질 정량 uv법
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